Para la secuenciación automatizada se utiliza DNA, el cual puede estar clonado en un vector o haber sido directamente amplificado por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). El éxito en los resultados de secuenciación, está directamente relacionado con la calidad del templado (DNA) y para ello, es de suma importancia atender los siguientes requerimientos para el procesamiento y entrega de las muestras: 1. Extracción y Purificación de DNA. La extracción de DNA plasmídico se realizará mediante columnas Miniprep (“kits”).
La purificación de productos de PCR se realizará mediante columnas (“kits”) y se recomienda utilizar preferentemente las siguientes marcas de Miniprep o columnas; QIAGEN y/o ROCHE (Boehringer), ya que son las que dan mejores resultados. El usar otras marcas reduce las posibilidades de tener éxito o reproducibilidad en los resultados.
Eluir el DNA (plásmido o producto de PCR) de la columna en 50 µl de H2O HPLC o MiliQ estéril (no utilizar el “buffer” de elusión que contienen los “kits” ni el buffer TE).
Para transformar, se recomienda utilizar las cepas de E. coli DH5a, HB101, XL1-blue y OneShot para posteriormente obtener los templados (plásmidos recombinantes). 2. Cuantificación de DNA El DNA debe estar visualizado en un gel de agarosa al 1% después de haber sido purificado (colocar 3µl en cada pozo y teñir con bromuro de etidio) y tomar fotografía del gel. Para determinar la concentración, ésta debe cuantificarse por espectrofometría a una longitud de onda de 260nm (ambas condiciones son importantes ya que el DNA puede tener contaminación de DNA genómico o RNA que afectan la absorbancia a 260nm por lo que la concentración de DNA plasmídico o producto de PCR será sobreestimada). Además es necesario cuantificar contaminantes de proteínas a 280nm y carbohidratos a 230nm y realizar las siguientes correlaciones: - Determinar las relaciones: 260/280 = rangos ~1.8-2.0
230/260 = rango 0.3-0.6
- Una vez obtenida la absorbancia del DNA, determinar la concentración en base a la regla que 1 OD a 260nm = 50ng/µl.
3. Concentración del DNA para su secuenciación Todas las muestras deben estar en agua grado HPLC o MiliQ.
Colocar en un tubo de 200µl (de PCR) el DNA en un volumen final de 15 µl, a una concentración dependiendo de la molécula: - PCR (1000 pb): 100 ng, es decir, 10 ng de DNA templado por cada 100 bp de producto de PCR.
- Plásmido (3-10 kb): 500-750 ng.
- Plásmido (10-20 kb): 1-1.2 µg.
- Lambda: 1.5 µg total.
- Cadena sencilla: 20 ng/µl (100 ng).
- Cósmido: 1 µg.
Preparar una alícuota de cada oligonucleótido a utilizar a 5 pmol/µl. Adicionar 1 µl (5 pmol/µl) del oligonucleótido a utilizar a cada tubo. Oligonucleótidos con los que cuenta la Unidad de Diagnóstico: T7 5´- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3´
SP6 5' - ATT TAG GTG ACA CTA TAG - 3' Es preferible que las muestras no se procesen bajo alguna de las condiciones siguientes: - Diluidas en “buffer” TE o “buffer” de elusión de los “kits”
- Con Sales (230/260 elevado)
- A 260/280 fuera de rango
- Con elevada contaminación de DNA genómico
- Con el RNA superior a 1µg.
- En vectores de clonación de crecimiento lento como JM101.
- Con etanol o fenol.
Responsables:
Dra. Elsa María Tamayo
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M. en C. Rosa Elena Gómez Barreto
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Col. Santa María Ahuacatitlán
Cerrada los Pinos y Caminera,
C.P. 62100 Cuernavaca, Morelos, México.
Tel. (01) 777 3293000, ext: 2266 y 2732;
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